Laporan Elektroforesis DNA | BIOLOGI

Visit to salambiologi.blogspot.com

A. Latar Belakang 

      Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama  peneliti  yang  berkaitan  dengan  genetika  ataupun  molecular.  Seiring dengan  kemajuan  zaman  yang  semakin  pesat  dinegara-negara  berkembang  akan selalu  diikuti  pula  dengan  kemajuan  ilmu  pengetahuan  yang  semakin  marak dibidang  teknologi.  Salah  satu  diantaranya  adalah  pengembangan  di  bidang Biologi Molekul. Bidang  ilmu  pengetahuan Bidang Molekuler  ini  telah  dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa  berbagai  kegiatan  penelitian  di  bidang  Kimia,  Biologi  (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).

     Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik  terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal  ini  termasuk  juga  protein.  Elektroforesis  berasal  dari  bahasa  Yunani  yang mempunyai  arti  transport  atau  perpindahan  melalui  partikelpartikel  listrik. Metode elekroforesis  telah  digunakan  dan  dikembangkan  didalam  teknik  analisa  untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode  tersebut berkembang sangat pesat sekali  di  zaman  kemajuan  teknologi,  disebabkan  karena  pengerjaannya  sangat sederhana  dan  sangat  mudah.  Di  dalam  ilmu  biologi  maupun  biologi  molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. 

B.    Tujuan dan Manfaat Praktikum

1.    Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
•    Untuk  mengetahui  alat-alat  yang  digunakan  dalam  proses  elektroforesis dan cara penggunaanya.

TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis  merupakan  proses  bergeraknya  molekul  bermuatan  pada suatu  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak  pada  medan  listrik tergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran.  Dengan  demikian  elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).Posisi molekul yang  terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,  ataupun  dilakukan  kuantifikasi  dengan  densitometer. Elektroforesis untuk  makromolekul  memerlukan  matriks  penyangga  untuk mencegah  terjadinya difusi  karena  timbulnya  panas  dari  arus  listrik  yang digunakan. Elektroforesis  biasanya  memerlukan  media  penyangga  sebagai  tempat bemigrasinya  molekul-mulekul  biologi.  Media  penyangganya  bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai  dalam  elektroforesis  antara  lain  yaitu  kertas,  selulose,  asetat  dan  gel.  Gel poliakrilamid  dan  agarosa  merupakan  matriks  penyangga  yang  banyak  dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.  Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:  (Soedarmadji, 1996)

1.    Ukuran molekul protein

Migrasi  molekul  protein  berukuran  besar  lebih  lambat  daripada  migrasi molekul berukuran kecil.

2.    Konsentrasi gel

Migrasi molekul  protein  pada gel  berkosentrasi  rendah  lebih  cepat  daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3.    Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena  ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran  listrik  menjadi  maksimal.  Hal  ini  dapat  mempercepat  gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4.    Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai  migrasi  elektron  atau  penyaringan  berdasarkan  ukuran  molekulseperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

5.    Kekuatan voltase

•    Jika  ukuran  pori  dari  medium  kira-kira  sama  dengan  molekul,  maka molekul  yang  lebih  kecil  akan  berpindah  lebih  bebas  di  dalam  medan listrik,  sedangkan  molekul  yang  lebih  besar  akan  dibatasi  dalam migrasinya.  Besarnya  pori-pori  dapat  diatur  dengan  mengubah konsentrasi  penyusun  gel  poliakrilamidnya  yaitu  akrilamid  dan bisakrilamid

•    Voltase  yang  dipakai  rendah  (100-500)  V,  kecepatan  migrasi  molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

•    Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah  serta  jenis  arus  yang  dipakai  selalu  harus  searah  (bukan  bolak balik).

6.    Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi  akan mempercepat  proses  bermigrasinya  protein  dan  sebaliknya  jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin  rendah berat molekulnya maka  semakin  jauh pula protein bergerak  atau mobilitasnya  tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih  besar  akan  bergerak  pada  jarak  yang  lebih  pendek  atau mobilitasnya  rendah (Sumitro et al., 1996).  Hasil  elektroforesis  akan  didapatkan  pita-pita  protein  yang  terpisahkan berdasarkan  berat molekulnya.  Tebal  tipisnya  pita  yang  terbentuk  dari  pita  protein menunjukkan  kandungan  atau  banyaknya  protein  yang  mempunyai  berat  molekul yang  sama  yang  berada  pada posisi  pita  yang  sama. Hal  ini  sejalan  dengan  prinsippergerakan molekul  bermuatan,  yakni molekul  bermuatan  dapat  bergerak  bebas  di bawah pengaruh medan  listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

Materi praktikum

1.    Alat dan Bahan Praktikum.
    Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Tabung  eppendorf.
•    Mikropipet.
•    Cetakan gel 20x16x1 cm3.
•    Valcon
•    Meja pendingin
•    Gloves   


2.     Bahan yang digunakan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Saparation gel komponen.
•    Acrylamide 30% .
•    4x separation buffer.
•    50% glycerol.
•    Air seteril.
•    10% APS/ammonium persulpat.



Metode Praktikum
Adapaun metode yang digunakam dalam praktikum ini yaitu :
•    Siapkan buffer,air seteril.
•    Semua bahan dicampur dalam 1 campuran.
•    Masukkan dalam cetakan.
•    Mengambil bahan dan masukkan dalam vacuum
•    Mengambil 4x separation buffer ,50%glicerol, air seteril
•    Semprotkan dengan pipet kedalam cetakan.
•    Tunggu selama 15 menit baru dimasukkan ke 2.
•    Masukkan lapisan ke 2.
•    Lepas dari penjepit dan ambil sisirnya.
•    Masukkan dalam dump yang berisi buffer.
•    Menyiapkan sampel .
•    Sebelumnya sampel dicampur dalam evendorf kosong , sama 2x sampel buffer tergantung kebutuhan.
•    Dan diruning selama 3 jam dan 10 voult baru dikeluarkan.

•    Pengecetan peronit setelah dari elektroporesis dengan mengkumasi berlian blue cuci dengan cairan methanol,akuades,asam asetat.

Tempat dan Tanggal Praktikum

Tempat Praktikum

    Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

Tanggal Praktikum
    Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi  ini pada hari Rabu, 30 November 2011.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Praktikum

Dari hasil praktikum yang dilakukan terdapat

1.    Pembuatan gel

Cara  pembuatan  gel  adalah  dengan  melarutkan  gel  bubuk  yang  khusus digunakan  untuk  elktroforesis  pada  erlenmeyer,  kemudian  di  cetak  pada  cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering.  Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan .

2.    Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan  pisau.  Bagian  ujung  gel  diiris  atau  dibuat  sumuran  dengan  cetakan khusus  kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak  enzim. Ekstar enzim yang  akan diuji dikeluarkan dari  freezer dan dibiarkan sebentar  hingga  mencair.  Pengambilan  ekstrak  enzim  dilakukan  dengan  cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipt mikro.  Potongan  kertas  saring  yang  telah  berisi  ekstrak  enzim  diletakkan  dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

3.    Proses Elektroforesis

Gel  yang  telah  siap  kemudian  diletakkan  secara  horizontal  diatas  kotak elektroforis  yang  telah  berisi  larutan  penyangga  elektroda.  Proses  ini  dilakukan  di  dalam  lemari  pendingin  dengan  suhu  40C.  Kedua  sisi  gel  diberi  spons  yang  telah  dibasahi  dengan  larutan  penyangga  elektroda  sebagai  jembatan  anatar  larutanpenyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut  diberi  gel  yang  dingin.  Proses  elekrofororsis  dijalankan  dengan  memberi daya  listrik  pada  gel. Pemberian  daya  listrik  disesuaikan  dengan  sampel  yang  akan digunakan, misalnya sebesar 50-70  A, 50-60  A atau 45-55  A selama kurang lebih 3  jam. Setelah  terlihat bahwa biru brom  fenol mencapai  titik yang berjarak ± 3  cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai  dipotong,  sedangkan  potongan  gel  yang  menjadi  tempat migrasi  enzim  diiris  tipis secara  horizontal  dengan  menggunakan  gergaji  yang  berkawat  tipis.  Gel  diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.

4.    Metode Analisis

Dalam hal  ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis  tersebut  sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita  (bandmorp). Macam pola pita dibedakan  atas  tipe pola pita  yang  terbentuk.  Semua  tipe  pola  pita  yang  terbentuk  diinterpretasikan  sebagai lokus  isozim  dan  alel  yang  kemudian  dijadikan  dasar  dalam  pengukuran  parameter yanga da dalam suatu populasi. 

PENUTUP

Kesimpulan

Adapun kesimpulan dari praktikum ini yaitu :

Elektroforesis  merupakan  proses  bergeraknya  molekul  bermuatan  pada suatu  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak  pada  medan  listrik tergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran.  Dengan  demikian  elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang  terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,  ataupun  dilakukan  kuantifikasi  dengan  densitometer.

Elektroforesis  untuk  makromolekul  memerlukan  matriks  penyangga  untuk mencegah  terjadinya  difusi  karena  timbulnya  panas  dari  arus  listrik  yang digunakan.  Gel  poliakrilamid  dan  agarosa  merupakan  matriks  penyangga  yang banyak  dipakai  untuk  separasi  protein  dan  asam  nukleat.  Elektroforesis  yang dibahas di bawah  ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida  (PAGE = polyacrilamida  gel  electrophoresis)  untuk  separasi  sampel  protein.  Banyak molekul  biologi  bermuatan  listrik  yang  besarnya  tergantung  pada  pH  dan komposisi medium  dimana molekul  biologi  tersebut  terlarut. Bila  berada  dalam suatu  medan  listrik,  molekul  biologi  yang  bermuatan  positif  akan  bermigrasi keelektroda  negatif  dan  sebaliknya.  Prinsip  inilah  yang  dipakai  dalam  elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya. 

Saran

Saran pada praktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan  sendiri  dan  dilakukan  proses  elektroforesis  yang  sebenarnya  supaya praktikan lebih mengetahi cara menggunakan metode elektroforesis.

DAFTAR PUSTAKA

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.   Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta.
Sudarmadji,  S.,  1996.  Teknik  Analisa  Biokimiawi.  Edisi  Pertama.Liberty.Yogyakarta.
Sumitro,  S.  B,  Fatchiyah,  Rahayu,  Widyarti,  dan  Arumningtyas.  1996.  Kursus Teknik-Teknik  Dasar  Analisis  Protein  dan  DNA.  Jurusan  Biologi  FMIPA Universitas Brawijaya. Malang.
Zubay,  G.  L.  1989.  Biochemistry  2nd  Edition. Mcmillan  Publishing  Coorporation.New York

Laporan Enzim Restriksi | BIOLOGI

Visit to salambiologi.blogspot.com

Pendahuluan

Enzim restriksi endonuklease adalah enzim-enzim bakteri yang dapat mengendalikan dan memotong sekuens nukleotida tertentu di dalam molekul DNA beruntai ganda. Enzim-enzim tersebut memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan panjang bervariasi, bergantung pada berapa banyak situs yang dikenali enzim tersebut berada di dalam molekul DNA. Sebagian enzim restriksi endonuklease yang digunakan untuk pengklonan biasanya mampu mengenali sekuans pasangan basa sepanjang 4-8 nukleotida dan melakukan pemotongan di dalam nukleotida tersebut. Banyak pula enzim restriksi yang dapat mengenali sekuens yang disebut palindrom. Palindrom adalah sekuens yang identik jika dibaca dalam arah 5’→3’ pada kedua untai molekul DNA. Hasil potongan enzim restriksi endonuklease pada DNA dapat berupa fragmen-fragmen dengan ujung yang kohesif (“sticy”) atau tumpul (blunt) (Stanfield 2006).

Enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini adalah EcoRI. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada senbarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends (Campbell 2002).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan dapat melakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi.

Metode

Tahapan dalam metode kerja praktikum pemotongan DNA dengan enzim restriksi, yaitu pada tabung eppendorf kecil (500 µl) dimasukkan 5-10 µl DNA, 5 µl larutan penyangga, 1 µl enzim restriksi, dan H₂O hingga volume larutan menjadi 50 µl. Larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37̊C. Selanjutnya dielektroforesis dengan gel agarosa selama 1-2 jam. DNA yang telah terpotong dan dimigrasikan di dalam gel agarosa siap untuk keperluan selanjutnya. Sebelumnya, diberi penanda ukuran molekuler.

Hasil Percobaan

Lamda pGEM

Sumur yang tidak mengandung DNA

Gambar 1 Hasil pemotongan fragmen DNA dengan enzim restriksi EcoRI.

Pembahasan

Teknologi DNA rekombinan memanfaatkan pemotongan dan penyambungan DNA. Teknik ini berkembang setelah ditemukan suatu enzim endonuklease yang dapat memotong DNA pada posisi dengan runtunan basa tertentu, sehingga disebut sebagai restriction endonuclease atau restriction enzyme atau diterjemahkan sebagai enzim endonuklease restriksi. Selain itu dikenal juga istilah ruas restriksi, yaitu ruas-ruas DNA tempat pemotongan oleh enzim (Jusuf 2001).

Pemanfaatan teknik DNA rekombinan dalam usaha penyisipan suatu gen dari DNA donor ke plasmid bakteri membutuhkan enzim yang cocok untuk pemotongan DNA. Oleh karena itu, mula-mula harus diketahui terlebih dahulu ruas-ruas restriksi yang mengapit gen yang akan diisolasi. Selain itu, setiap enzim restriksi bersikap selektif sehingga akan dikenali oleh nama dan runtunan basa ruas restriksinya. Enzim yang digunakan pada praktikum ini adalah enzim EcoRI. Enzim ini hanya mengenali urutan (sekuen) 5′-G’AATCC-3′ (Saputra 2008).

Hasil praktikum pemotongan DNA dengan enzim restriksi EcoRI, menunjukakan bahwa hampir semua sumur mengandung potongan fragmen DNA. Hanya ada satu sumur, yaitu sumur ke-13 tidak mengandung potongan fragmen DNA. Hal ini terjadi kemungkinan karena kesalahan praktikan pada saat melakukan prosedur percobaan.

Praktikum ini menggunakan larutan buffer dalam pembuatan gel agarosa. Larutan buffer yang digunakan berfungsi untuk penyangga pH pada gel agarosa dan untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis.  Buffer ini dibuat dengan tris asetat-EDTA (TAE). Pada praktikum ini juga digunakan ddH2O yang merupakan air yang sanagat murni karena telah melalui beberapa proses pemurnian. Larutan ini berfungsi sebagai pelarut semua komponen zat yang tidak akan disertakan dalam proses restriksi. Larutan ini juga berfungsi mensuspensikan endapan DNA (Lodish et al 1995)

Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum, pemotongan DNA dengan enzim restriksi EcoRI berhasil dilakukan. Hal itu dapat terlihat dari pita DNA yang berhasil terbentuk. Akan tetapi ada satu sumur, yaitu sumur ke-13 tidak berhasil running, karena tidak terlihat adanya pita DNA. Hal ini kemungkinan diakibatkan oleh kesalahan praktikum dalam proses palaksanaan prosedur percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell N.A, J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2002 Biologi, Edisi Kelima. Rahayu Lestari, penerjemah. Biology, Fifth Edition. Jakarta: Erlangga.

Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor: Sagung Seto.

Lodish H et al.. 1995. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books.

Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus thuringiensis dengan elaktroforesis medan berpulsa [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Stanfield W.D, J.S Colome, R.J Cano. 2006. Schaum’s Easy Outlines Biologi Molekuler dan Sel. Varian Fahmi, penerjemah. Schaum’s Easy Outlines Molecular and Cell Biologi. Jakarta: Erlangga.

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga. 
http://roma297.wordpress.com/2011/05/01/pemotongan-dengan-enzim-restriksi/

Laporan Transformasi DNA | BIOLOGI

 Visit to salambiologi.blogspot.com

Pendahuluan
Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri (Cowell & Austin 1997).  Metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya (Hanahan  1983). Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentanterhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Cowell & Austin 1997).
Keberadaan DNA asing yang berintegrasi dapat menyebabkan sel yang mengambilnya berubah sifat (Jusuf M 2001). Kemampuan bakteri mengambil material dari lingkungan sekitarnya dapat didukung oleh proses perlakuan konjugasi atau perlakuan fisik dan kimia atau transduksi. Bakteri yang digunakan pada praktikum ini adalah Escherichia coli.Sebelum proses transformasi dilakukan bakteri ini perlu dibuat menjadi sel kompeten agar E.coli dapat mengambil DNA dari lingkungannya (Widodo 2002). Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dapat dilakukan dengan resistensi antibiotika misalnya ampisilin dan seleksi warna salah satunya teknik seleksi biru putih. Seleksi biru putih yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert (Brown 1995). Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida). Koloni yang berwarna biru artinya tidak mengandung DNA sisipan, sedangkan koloni berwarna putih artinya DNA bakteri mengandung DNA sisipan.

Tujuan
Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui cara introduksi DNA ke E.coli

Metode

1. Pembuatan sel kompeten

Satu koloni bakteri Escherichia coli diambil dengan tusuk gigi steril dan dibiakkan dalam eppendorf yang berisi 500 μl TFB (Transformation Buffer). Resuspensi dilakukan terhadap tabung eppendorf (vortex). Selanjutnya, eppendorf diinkubasi di dalam es selama 5 menit dan disentrifuse pada 5000 rpm selama 5 menit. Endapan (pelet) hasil sentrifuse ditambahkan dengan 500 μl TFB dan diresuspensi atau divortex kembali. Setelah itu, ditambahkan 1/12 volume TFB dan DMSO ± 20,8 μl. Campuran diresuspensi dan kemudian diinkubasi di dalam es selama 10 menit.
Pembuatan sel kompeten terdiri dari dua metode yaitu, di dalam laminar dan di luar laminar. Kelompok kami melakukan metode yang kedua yaitu pembuatan sel kompeten di luar laminar.
2. Transformasi bakteri
Sebanyak 50 μl sel kompeten diambil dan ditambahkan dengan 10 μl hasil ligasi, lalu diinkubasi di dalam es selama 20 menit. Campuran tersebut kemudian segera dipanaskan (heat shock) pada 42^oC selama 45 detik. Setelah perlakuan heat shock, campuran diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Campuran ditambahkan dengan 100 μl YT dan diinkubasi kembali pada suhu 37^oC pada shaker kecepatan 250 rpm selama 20 menit. Tahap akhir adalah bakteri disebar di atas media padat. Komposisi media pertama (kontrol +) adalah LA (Luria Agar), media kedua (kontrol -) berisi LA dan ampisilin, media ketiga (kontrol transformasi) berisi Luria Agar, X-gal, dan IPTG.
Pembahasan
Seleksi biru putih (blue-white screening) yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert. Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida) (Brown TA 1995). Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna biru karena senyawa X-gal dalam medium (Wibowo 2002). Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. X-gal adalah molekul yang mirip galaktosa, sedangkan IPTG merupakan inducer enzim β-galaktosidase. Hasil ini sesuai dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru, sehingga dapat dikatakan percobaan meligasikan dan transformasi fragmen DNA berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih. Jika koloni berwarna biru artinya proses transformasi yang dilakukan tidak berhasil hal ini dapat terjadi karena ukuran insert terlalu kecil sehingga tidak mampu membuat gen lacZ terinaktifasi atau posisi sisipan yang tidak tepat, dan insert  yang diklon bersifat meracuni bagi sel bakteri.
Proses transformasi bakteri diawali denga pembuatan sel kompeten. Pencampuran sel kompeten dan DNA insert diinkubasi bersama dengan larutan kalsium klorida (CaCl₂) yang terdapat pada TFB, fungsi larutan ini adalah megganggu keseimbangan kalsium dalam membran sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat masuk. Cara kerja larutan ini adalah membantu terbukanya protein integral sebagai kanal ion. Proses selanjutnya yaitu dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42°C selama 45 detik dengan maksud membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Proses pengerjaan transformasi dapat dilakukan di dalam laminar ataupun di luar laminar. Perbedaannya hanya pada kesterilan kerja dan resiko kontaminasi pada pekerjaan di luar laminar.
Transformasi dikatakan berhasil apabila rangkaian DNA yang diintroduksikan dapat disisipkan ke genom sel inang (bakteri), diekspresikan, dan terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dapat dilakukan denan dua cara yaitu seleksi resistensi antibiotika dan seleksi warna. Sel yang mengandung plasmid tanpa insert ditumbuhkan pada media LA dan ampisilin tersebut maka gen lac-Z akan terekspresikan dan β-galaktosidase dihasilkan serta menghasilkan koloni biru. Enzim ini akan memecah X-gal dan menghasilkan senyawa berwarna biru, begitu pula sebaliknya, jika sel yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan atau berhasil tersisipi maka pada media LA tersebut, maka gen lac-Z tidak akan diekspresikan dan β-galaktosidase tidak akan terbentuk. Koloni akan berwarna putih (Brown 1995).
Hasil percobaan menunjukan tiga gambar yaitu kontrol positif digunakan untuk mengetahui kompetensi sel pada media tanpa ampisilin, control neatif menunjukan sel bakteri yang tidak tersisipi akan mati pada media LA dan ampisilin, kontrol transformasi  untuk mengukur tingkat keberhasilan transformasi X-gal dan IPTG. Morfologi bakteri  pada media yang berhasil tumbuh tersebut terlihat bulat dan saling bergerombol. Penggunaan kontrol positif dan kontrol negatif dalam transformasi berfungsi sebagai pembanding. Tingkat keberhasilan transformasi ditentukan oleh kompetensi sel. Ukuran, konsentrasi DNA.

Simpulan
Proses transformasi yang dilakukan pada sel bakteri Escherichia coli berhasil dilakukan ditandai dengan adanya koloni putih pada cawan media kontrol positif dan kontrol transformasi dengan media X-gal dan IPTG. Koloni yang berhasil tersisipi DNA insert ini akan berwarna putih. Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dengan antibiotic ampisilin menunjukkan pada kontrol negatif tidak adanya koloni bakteri yang tumbuh, artinya bahwa bakteri yang digunakan tidak resisten terhadap antibiotik, jika tersisipi DNA insert bakteri ini akan resisten terhadap antibiotik.

Daftar Pustaka
http://puspalarasati.wordpress.com/2011/06/09/transformasi-bakteri/