Laporan Enzim Restriksi | BIOLOGI

Visit to salambiologi.blogspot.com

Pendahuluan

Enzim restriksi endonuklease adalah enzim-enzim bakteri yang dapat mengendalikan dan memotong sekuens nukleotida tertentu di dalam molekul DNA beruntai ganda. Enzim-enzim tersebut memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan panjang bervariasi, bergantung pada berapa banyak situs yang dikenali enzim tersebut berada di dalam molekul DNA. Sebagian enzim restriksi endonuklease yang digunakan untuk pengklonan biasanya mampu mengenali sekuans pasangan basa sepanjang 4-8 nukleotida dan melakukan pemotongan di dalam nukleotida tersebut. Banyak pula enzim restriksi yang dapat mengenali sekuens yang disebut palindrom. Palindrom adalah sekuens yang identik jika dibaca dalam arah 5’→3’ pada kedua untai molekul DNA. Hasil potongan enzim restriksi endonuklease pada DNA dapat berupa fragmen-fragmen dengan ujung yang kohesif (“sticy”) atau tumpul (blunt) (Stanfield 2006).

Enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini adalah EcoRI. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada senbarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends (Campbell 2002).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan dapat melakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi.

Metode

Tahapan dalam metode kerja praktikum pemotongan DNA dengan enzim restriksi, yaitu pada tabung eppendorf kecil (500 µl) dimasukkan 5-10 µl DNA, 5 µl larutan penyangga, 1 µl enzim restriksi, dan H₂O hingga volume larutan menjadi 50 µl. Larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37̊C. Selanjutnya dielektroforesis dengan gel agarosa selama 1-2 jam. DNA yang telah terpotong dan dimigrasikan di dalam gel agarosa siap untuk keperluan selanjutnya. Sebelumnya, diberi penanda ukuran molekuler.

Hasil Percobaan

Lamda pGEM

Sumur yang tidak mengandung DNA

Gambar 1 Hasil pemotongan fragmen DNA dengan enzim restriksi EcoRI.

Pembahasan

Teknologi DNA rekombinan memanfaatkan pemotongan dan penyambungan DNA. Teknik ini berkembang setelah ditemukan suatu enzim endonuklease yang dapat memotong DNA pada posisi dengan runtunan basa tertentu, sehingga disebut sebagai restriction endonuclease atau restriction enzyme atau diterjemahkan sebagai enzim endonuklease restriksi. Selain itu dikenal juga istilah ruas restriksi, yaitu ruas-ruas DNA tempat pemotongan oleh enzim (Jusuf 2001).

Pemanfaatan teknik DNA rekombinan dalam usaha penyisipan suatu gen dari DNA donor ke plasmid bakteri membutuhkan enzim yang cocok untuk pemotongan DNA. Oleh karena itu, mula-mula harus diketahui terlebih dahulu ruas-ruas restriksi yang mengapit gen yang akan diisolasi. Selain itu, setiap enzim restriksi bersikap selektif sehingga akan dikenali oleh nama dan runtunan basa ruas restriksinya. Enzim yang digunakan pada praktikum ini adalah enzim EcoRI. Enzim ini hanya mengenali urutan (sekuen) 5′-G’AATCC-3′ (Saputra 2008).

Hasil praktikum pemotongan DNA dengan enzim restriksi EcoRI, menunjukakan bahwa hampir semua sumur mengandung potongan fragmen DNA. Hanya ada satu sumur, yaitu sumur ke-13 tidak mengandung potongan fragmen DNA. Hal ini terjadi kemungkinan karena kesalahan praktikan pada saat melakukan prosedur percobaan.

Praktikum ini menggunakan larutan buffer dalam pembuatan gel agarosa. Larutan buffer yang digunakan berfungsi untuk penyangga pH pada gel agarosa dan untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis.  Buffer ini dibuat dengan tris asetat-EDTA (TAE). Pada praktikum ini juga digunakan ddH2O yang merupakan air yang sanagat murni karena telah melalui beberapa proses pemurnian. Larutan ini berfungsi sebagai pelarut semua komponen zat yang tidak akan disertakan dalam proses restriksi. Larutan ini juga berfungsi mensuspensikan endapan DNA (Lodish et al 1995)

Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum, pemotongan DNA dengan enzim restriksi EcoRI berhasil dilakukan. Hal itu dapat terlihat dari pita DNA yang berhasil terbentuk. Akan tetapi ada satu sumur, yaitu sumur ke-13 tidak berhasil running, karena tidak terlihat adanya pita DNA. Hal ini kemungkinan diakibatkan oleh kesalahan praktikum dalam proses palaksanaan prosedur percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell N.A, J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2002 Biologi, Edisi Kelima. Rahayu Lestari, penerjemah. Biology, Fifth Edition. Jakarta: Erlangga.

Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor: Sagung Seto.

Lodish H et al.. 1995. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books.

Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus thuringiensis dengan elaktroforesis medan berpulsa [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Stanfield W.D, J.S Colome, R.J Cano. 2006. Schaum’s Easy Outlines Biologi Molekuler dan Sel. Varian Fahmi, penerjemah. Schaum’s Easy Outlines Molecular and Cell Biologi. Jakarta: Erlangga.

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga. 
http://roma297.wordpress.com/2011/05/01/pemotongan-dengan-enzim-restriksi/