Visit to salambiologi.blogspot.com
A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif
B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi
menjadi tiga, yaitu :
1.
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik
pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya
menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa
yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal
violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi
menjadi dua jenis pewarnaan.
a. pewarnaan
asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan
satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat
warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
b. Pewarnaan
Basa
Pewarnaan basa atau negatif
merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2.
Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram
adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini
pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
a.
Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri
yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram.
Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b.
Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri
yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri
jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3
lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan
tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna
merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan
yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel
menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan
warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin
akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram
negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan
relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
|
Bakteri garam (+)
|
Bakteri gram negatif(-)
|
Komposisi dinding sel
|
Kandungan lipid rendah (1-4%)
|
Kandungan lipid tinggi
|
Ketahanan terhadap penisilin
|
Lebih sensitif
|
Lebih tahan
|
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)
|
Lebih dihambat
|
Kurang dihambat
|
Kebutuhan nutrisi
|
Kebanyakan spesies relatif kompleks
|
Relatif sederhana
|
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
|
Lebih tahan
|
Kurang tahan
|
(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum
digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin
dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas
tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk
mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka
sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat,
artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam
alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat
yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak
digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang
dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri
biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin
yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya
dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh
terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut
tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan
carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan
diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering
selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu
kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan.
Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada
sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3
menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai
menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci
dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
4. Pewarnaan
Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode
pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti
bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium,
Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan
bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan
mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi,
dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan
endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora
tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak
sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan
sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan
kapsul
Pewarnaan ini menggunakan
larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan
dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar
belakang yang berwana biru gelap.
b.
Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak
permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.
c.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi
suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk
presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d.
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan
pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).
A. Alat dan Bahan
NO
|
Alat
|
Jumlah
|
Bahan
|
1
|
Jarum ose
|
1
|
Biakan murni B. cereus dan E.colipada medium NA yang berumur
24 jam
|
2
|
Pembakar spirtus
|
1
|
Aquades steril
|
3
|
Kaca preparat
|
1
|
Larutan hucker’s crystal violet
|
4
|
Pipet tetes
|
1
|
Larutan mordan lugol iodine
|
5
|
Mikroskop
|
1
|
Larutan alkohol 96%
|
6
|
Gelas kimia
|
3
|
Larutan safranin
|
7
|
Kaca objek
|
1
|
|
8
|
Tabung reaksi
|
1
|
B.
Kaca Objek
|
Cara Kerja
Dibersihkan dengan menggunakan
alkohol
Dikeringkan dengan cara
dianging-anginkan pada api
Kaca objek yang telah steril
|
Ditetesi aquades
Jarum ose
|
Dibakar sampai merah
Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
|
Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api
Sampel e.coli dan Bacillus
|
Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan
sampai terambil).
Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai
tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek
Kaca objek yang telah berisi
sampel
|
Dikeringkan
dengan cara dipanaskan di atas api kecil.
Ditetesi
violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1
menit)
Dicuci
dengan air yang mengalir
Ditetesi
lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci
dengan air yang mengalir
Ditetesi
alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci
dengan air yang mengalir
Ditetesi
safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci
dengan air yang mengalir
Dikeringkan
pada udara terbuka
Hasil
|
Diamati dibawah mikrosko
A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Tabel pengamatan
Gambar 1.
Fiksasi
Sumber : dokumentasi Pribadi
|
Bakteri yang telah di ambil kemudian di simpan pada
kaca objek yang dicampur dengan setetes aquades. Setelah itu difiksasi di
atas api sampai kering. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa
merusak sel bakteri.
|
Gambar 2.
Pada saat ditetesi violet
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet. Sampai
bakteri terendam. Lalu biarkan selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air yang
mengalir. Hasilnya terdapat warna ungu pada kaca objek.
|
Gambar 3.
Penambahan lugol
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai terendam lalu
biarkan 1 menit dan cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca objek
tetap berwarna ungu akibat dari tetesan violet.
|
Gambar 4.
Saat ditetesi alkohol 96%
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri ditetesi
alkohol 96% dan dibiarkan selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air yang
mengalir. Setelah dicuci, warna ungu pada kaca objek menghilang akibat
penambahan dari alkohol.
|
Gambar 5.
Pada saat ditetesi safranin
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Setelah warna ungu pada bakteri hilang, kemudian
bakteri ditetesi safranin sampai terendam dan biarkan selama 1 menit.
Kemudian cuci di air yang mengalir. Hasilnya, bakteri yang dihasilkan
berwarna merah muda.
Gambar 6.
Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi
|
Gambar 7.
Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar B.
cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan
praktikum mikrobiologi
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan
diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding
sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel
selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada
di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Penambahan violet pada
bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal
violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan
dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal
violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan
respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1
menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada
dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan
pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang
diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan
penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang
diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96%
diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan
selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas
dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven
organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak
kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada
pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak
berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes
safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1
menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga
warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder.
Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna
utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan
warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau
pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif
dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut,
daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak
dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang
berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan
disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen
dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian
zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi
bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau
pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan
air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang
sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu
agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan.
Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah
mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram
positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan
bakteri gram negatif.
B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan
bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan gram negatif dan bacillus
yang berwarna ungu merupakan gram positif.
Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.
Jakarta : Gramedia.
Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y.
Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia
Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam
Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk
Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara
Kesehatan Vol. 9 No. 1.
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium
Mikrobiologi UNS.
http://alexschemistry.blogspot.com/2013/10/laporan-pewarnaan-bakteri-pewarnaan-gram.html
Tidak ada komentar:
Posting Komentar