Visit to salambiologi.blogspot.com
Pendahuluan
Sentrifugasi adalah metode
sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu fluida berdasarkan
berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975). Sentrifugasi
bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya
dapat diketahui (Miller 2000). Dalam bentuk yang sederhana sentrifus terdiri
atas sebuah rotor dengan lubang-lubang untuk melatakkan wadah/tabung yang
berisi cairan dan sebuah motor atau alat lain yang dapat memutar rotor pada
kecepatan yang dikehendaki. Semua bagian lain yang terdapat pada sentrifus
modern saat ini hanyalah perlengkapan yang dimaksudkan untuk melakukan berbagai
fungsi yang berguna dan mempertahankan kondisi lingkungan dimana rotor tersebut
bekerja. Penggunaan sentrifus cukup luas, meliputi koleksi dari pemisahan
sel, organel dan molekul (Hendra 1989).
Prinsip sentrifus bekerja seperti
komedi putar. Prinsipnya yakni dengan meletakkansampel pada suatu gaya dengan
memutar sampel pada kecepatan tinggi, sehingga terjadi pengendapan partikel,
atau organel-organel sel berdasarkan bobot molekulnya (Artika 2010). Substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan
akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi terbagi
menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil
sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisis dari
substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara
pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih
tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih
keruh.
Alat pengukur derajat keasaman (pH
meter) ialah alat digital yang digunakan untuk mengukur pH. Prinsipnya
menggunakan satuan ukur yang menguraikan derajat keasaman atau kadar alkali
dari suatu larutan. Standarisasi pH meter menggunakan larutan buffer dengan
menggunakan larutan yang belum diketahui nilai pHnya. Semua pH meter memiliki
kenop berlabel pengatur suhu yang digunakam untuk mengukur temperature dari
larutan yang diukur (Bernasconi). pH meter memiliki dua buah elektroda, yaitu
elektroda gelas dan elektroda kalomel. Elektroda gelas terdiri dari bola yang
sangat tipis dengan ketebalan 0,1 mm yang terdapat pada ujung pipa gelas yang
kuat dengan daya tahan tinggi. Bola tersebut mengandung HCl (0,1 mol/liter)
yang dihubungkan dengan kawat platina melalui elektroda Ag (Robinson
1975). Elektroda gelas di dalam larutan yang diukur menyusun setengah sel dan
rangkaian pengukur dilengkapi dengan elektrode acuan yang tidak sensitif
terhadap ion hidrogen. Elektroda acuan yang biasa digunakan adalah elektroda
kalomel. Elektroda kalomel bersifat stabil, mudah digunakan, dan memiliki
ketepatan tinggi dalam menentukan potensial elektroda standar (Hendra 1989).
Prinsip penggunaan pH meter
adalah berdasarkan pada potensial elektrokimia yang terjadi antara larutan
yang terdapat dalam elektroda gelas (membran gelas) yang telah diketahui dengan
larutan di luar elektroda gelasyang tidak diketahui sebelumnya. Hal ini
disebabkan oleh lapisan tipis dari gelembung kacaakan berinteraksi dengan ion
hidrogen yang ukurannya relatif lebih kecil dan aktif, sehinggaelektroda
tersebut akan mengukur potensial elektrokimia dari ion hidrogen. Sirkuit
elektrik harus dilengkapi dengan elektroda pembanding (kalomel). Hal yang
harus digaris bawahi adalah alat tersebut tidak mengukur arus tetapi hanya
mengukur tegangan (Bernasconi 1995).
Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan untuk
memperkenalkan prinsip kerja dan cara penggunaan alat–alat laboratorium di
laboratorium biokimia. Alat-alat tersebut meliputi pH meter dan sentifusa.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam
percobaan ini meliputi pH meter gelas, alat sentrifus, tabung sentrifus, labu
takar 50 ml, gelas piala 100 ml, gelas piala 200 ml, pipet volumetrik, pipet
tetes, labu erlenmeyer dan beker gelas.
Bahan yang digunakan pada praktikum
kali ini adalah aquades, suspensi kloroplas, Na2HPO4, asam
sitrat serta bufer pH 7 dan 4.
Prosedur Percobaan
Pada percobaan penggunaan pH meter,
disiapkan masing-masing 50 ml larutan 0,2 M fosfat (Na2HPO4.2H2O)
dan 50 ml 0,1 M sitrat. Selanjutnya melakukan standarisasi terhadap pH meter.
Dicampurkan 17,5 ml larutan fosfat ke dalam 32,5 ml larutan sitrat, lalu pHnya
diukur. Bila pH < 3,8 maka asam sitrat ditambahkan dengan pipet tetes hingga
pH menyentuh angka 4. Namun bila pH > 3,8 maka fosfat yang bersifat basa
ditambahkan dengan pipet tetes hingga pH menyentuh angka 7.
Pada percobaaan penggunaan
sentrifus, memindahkan suspensi kloroplas ke dalam satu tabung dingin yang ada
dalam bak es. Sebelum suspensi dimasukkan, terlebih dahulu tabung kosong
ditimbang dengan menggunakan neraca. Selanjutnya suspensi kloroplas dimasukkan
dan tabung yang berisi kloroplas di timbang kembali. Ada tiga tabung yang
berisi suspensi kloroplas yang digunakan dalam percobaan kali ini dan sebagai
penyeimbang menggunakan air untuk mengisi tabung lainnya. Perbedaan bobot kedua
tabung ini harus harus tidak lebih dari 100 mg. Selanjutnya tabung tersebut
diberi label. Tabung kemudian diletakkan di dalam rotor pada posisi yang
berlawananhingga tabung berada dalam keadaan seimbang. Selanjutnya memutar alat
sentrifus dengan kecepatan 1200 g selama 10 menit. Setelah selesai menuangkan
supernatannya dengan hati-hati ke dalam wadah lain, sehingga tidak tercampur
dengan pelet.
Hasil Percobaan
Tabel 1. Bobot pelet kloroplas
Sampel
|
Bobot
tabung kosong (g)
|
Bobot
tabung kosong+ kloroplas (g)
|
Bobot
tabung+ pellet (g)
|
Bobot
suspensi kloroplas
|
Bobot
pelet (g)
|
Rendemen
(% b/b)
|
1
|
15,88
|
34,68
|
21,71
|
18,80
|
5,83
|
0,3072
|
2
|
15,63
|
34,85
|
20,81
|
19,22
|
5,18
|
0,2695
|
3
|
15,70
|
34,77
|
20,51
|
19,07
|
4,81
|
0,2522
|
Contoh perhitungan :
Bobot pelet = (bobot tabung + bobot pllet)
– bobot tabung = 21,71 – 15,88 = 5,83
RCF = 1,12 x r x
1200 = 1,12 x 10-5x 7 cm
x
RPM = 3912,3039 4000
Keterangan :
RCF :
relative centrifugal force = gaya sentrifugasi yang dihasilkan
dibandingkan dengan percepatan gravitasi bumi
RPM : rotasi per
menit
r
: jari-jari rotor
Tabel 2. Penggunaan pH meter
Sampel
|
pH terukur
|
pH
Universal
|
Sampel 1
|
4,43
|
4
|
Sampel 2
|
4,31
|
4
|
Sampel 3
|
5,58
|
6
|
Sampel 4
|
7,31
|
7
|
Sampel 5
|
4,55
|
4
|
Contoh perhitungan:
Pembuatan larutan asam sitrat 0,1 M
M= x
0,1 M = x
gr= = 1, 0507 gr
Pembuatan larutan asam fosfat 0,1 M
M= x
0,2 M = x
gr= = 3,5814 gr
Pembahasan
Prinsip sentrifugasi didasarkan pada
pemisahan molekular dari sel atau organel subselular. Pemisahan tersebut
berdasarkan konsep bahwa partikel yang tersuspensi di sebuah wadah akan
mengendap (bersedimentasi) ke dasar wadah karena adanya gaya gravitasi.
Sehingga laju pengendapan suatu partikel yang tersuspensi tersebut dapat diatur
dengan meningkatkan atau menurunkan pengaruh gravitasional terhadap partikel.
Pengaturan laju pengendapan tersebut dapat dilakukan dengan cara menempatkan
wadah yang berisi suspensi partikel kemesin sentrifugasi tepatnya pada bagian
rotor yang kemudian akan berputar dengan kecepatan tertentu. Hal tersebut
tergantung pada ukuran dan bobot jenis dari suspensi. Teknik ini dapat
digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi dan komponen
selular. Hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet.
Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang
lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya
lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki
bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa
endapan) dan warnanya lebih keruh. () Berdasarkan praktikum yang telah
dilakukan sampel yang digunakan adalah klorofil. Data yang didapat dari
praktikum ini ialah data rendemen dengan tiga kali pengulangan, rendemen
pertama 0,3072 %b/b, rendemen kedua 0,2695 %b/b, dan rendemen yang ketiga
0,2522 %b/b. Rendemen adalah perbandingan antara minyak yang dihasilkan dengan
bahan tumbuhan yang diolah. Besarnya rendemen yang dihasilkan antara jenis
bahan yang satu berbeda dengan yang lainnya. (Anonim 2012) Bobot suspensi
kloroplas adalah berturut-turut sebagai berikut (1)18,80 ; (2)19,22 ; dan (3)
19,07.
Sentrifus digunakan dengan syarat dan
ketentuan sebagai berikut yaitu pertama, bobot tabung yang digunakan harus
seimbang agar gaya sentrifugal pada sentrifus menjadi seimbang. Keseimbangan
tersebut juga mempengaruhi kecepatan rotor. Jika tidak seimbang maka dapat
menyebabkan suspensi menjadi rusak bahkan terlempar ke luar bila sentrifus
tidak terkunci rapat karena timbulnya presisi. (Robinson 1975) Kedua, Sebelum
dijalankan sentrifus harus dalam keadaan vakum supaya tidak ada lagi gesekan
dengan udara dan suhu tidak naik ketika rotor sedang berputar. Kemudian yang
ketiga, homogenisasi dan fraksinasi dilakukan pada suhu 40C agar
meminimalisir degradasi enzim-enzim terhadap komponen sel. (Miller 2000)
Sentrifus yang digunakan pada percobaan ini adalah sentrifus berkecepatan
tinggi yang sering digunakan dalam laboratorium biokimia. (Hendra 1989)
Instrumen pHmeter dapat digunakan
untuk menentukan pH atau tingkat keasaman dari suatu sistem larutan.(Beran,
1996) Sifat asam atau basa suatu larutan dapat ditentukan dari jumlah ion
hidrogen yang terkandung di dalam larutan tersebut. Sifat keasaman dari suatu
larutan dapat ditentukan dengan dua cara yaitu yang pertama, menggunakan
kertas lakmus sebagai indicator asam atau basa dan yang kedua, menggunakan
instrumen pH meter yang memiliki akurasi cukup tinggi. Pada percobaan kali ini,
kita menentukan sifat keasaman suatu larutan dengan menggunakn pH meter.
Larutan yang digunakan adalah larutan campuran dari fosfat (bersifat basa) dan
asam sitrat (bersifat asam). pH meter yang baik haruslah dirawat dengan
baik pula agar nilai akurasi dan presisinya dapat terjaga. Berdasarkan hal
tersebut praktikan haruslah mengkalibrasi instrument pHmeter tersebut sebelum
digunakan untuk mengukur nilai pH suatu larutan. Prinsip kerja pada pHmeter ini
menggunakan arus listrik yang tercatat pada sensor pH akibat adanya suasana
ionic pada larutan. Keseimbangan sensor pH pada pHmeter harus dijaga dengan
cara mengkalibrasinya. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam penggunaan pH
buffer standar ini adalah menjaga pH meter dalam keadaan segar. Sensor pHmeter
selalu dicuci untuk menjaga akurasi alat serta mencegah kontaminasi pada pH
buffer. Selain itu, untuk lebih menjaga keawetan sensor, maka perlakuan sensor
apabila tidak dipakai harus direndam/tercelup dalam aquades. Dan yang terakhir
ialah temperature pHmeter harus selalu dijaga. Sebab, Kenaikan satu derajat
temperatur menyebabkan perubahan nilai pH berkisar antara 0,01 sampai 0,02.
Kalibrasi pHmeter dapat
dilakukan pada larutan standar dengan pH 4, pH 7, atau pH 10. Kalibrasi dapat
dilakukan dengan tiga metode yang dapat dipilih salah satu. Ketiga metode
tersebut adalah (1) metode satu titik pada sekitar pH yang akan diukur, yakni
kalibrasi dengan buffer standar pH 4,01 untuk sistem asam, buffer standar pH
7,00 untuk sistem netral, dan buffer standar pH 10,01 untuk sistem basa. (2)
metode dua titik (diutamakan) jika sistem bersifat asam, maka digunakan 2
buffer standar berupa pH 4,01 dan 7,00 Apabila sistem bersifat basa, digunakan
2 buffer standar berupa pH 7,00 dan 10,01 (3) metode multi titik yang dilakukan
dengan menggunakan 3 buffer standar. Akurasi dari nilai pH untuk setiap buffer
ditentukan sebagai fungsi temperatur.
Pada praktikum kali ini, praktikan
menggunakan metode dua titik yaitu dengan menggunakan dua larutan yaitu larutan
fosfat dan larutan asam sitrat. Dengan metode ini, praktikan memperoleh
data pH dalam bentuk pH terukur (menggunakan pHmeter) dan pH
universal(menggunakan indicator universal). Dalam hal ini, pH terukur lebih
akurat daripada pH universal. Hal itu disebabkanoleh pH terukur yang
menggunakan pHmeter memiliki sensor pH berupa arus listrik dalam larutan yang
bersifat ionic daripada pH universal yang hanya mengandalkan warna pada trayek
pH universal. pH terukur oleh pH meter berturut-turut untuk lima kali ulangan
ialah 4,43 ; 4,31 ; 5,58 ; 7,31 ; dan 4,55 sedangkan pH universal 4 ; 4 ; 6 ; 7
; dan 4. Data yang didapat ada yang tidak normal yaitu pada ulangan
keempat pH terukur 7,31 dan pH universal sebesar 7. Hal itu disebabkan karena
adanya kesalah saat mencampurkan asam sitrat seharusnya 32,5 mL namun
dimasukkan 17,5 mL dan fosfat yang seharusnya 17,5 mL dimasukkan 32,5 sehingga
membuat pH yang diukur berbeda dengan pH yang seharusnya pada rencana kerja.
Simpulan
Jadi, berdasarkan praktikum yang telah
dilakukan dapat disimpulkan bahwa sentrifus digunakan untuk mengendapkan
suspense kloroplas agar didapatkan supernatan yang terpisah dari pelet.
Sentrifus dengan rotor yang berkecepatan tinggi akibat adanya gaya gravitasi
dapat mengendapkan suspensi kloroplas dengan rendemen yaitu rendemen pertama
0,3072 %b/b, rendemen kedua 0,2695 %b/b, dan rendemen yang ketiga 0,2522 %b/b.
selain menggunakan sentrifus, praktikan juga menggunakan pHmeter dengan
mengkalibrasinya menggunakan metode dua titik (menggunakan larutan asam sitrat
dan fosfat) untuk membuat larutan buffer yang pH nya mendekati 4. pH dapat
diukur dengan pHmeter yang lebih akurat daripada pH universal dengan pH yang
terukur berturut-turut untuk 5 kali pengulangan yaitu 4,43 ; 4,31 ; 5,58 ; 7,31
; dan 4,55 serta pH universalnya berturut-turut untuk 5 kali pengulangan yaitu
4 ; 4 ; 6 ; 7 ; dan 4.
Daftar Pustaka
Anonim. [terhubung berkala]
Artika IM, Safithri M.
2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler.
Bogor:Departemen Biokimia.
Beran, J.A, 1996, Chemistry in The
Laboratory, John Willey & Sons.
Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia
I. Jakarta: Pradya Paramita.
Hendra Adijuwana. 1989. Teknik
pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.
Miller J.N. 2000. Statistics and
Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow:
Prentice. Hall.
Robinson J.R. 1975. Fundamental Of
Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell
Scientific Publication.
Sastrohamidjojo, H, 1991,
Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta.
Tahir, Iqbal. 2008. Arti Penting
Kalibrasi pada Proses Pengukuran Analitik : Aplikasi pada
Penggunaan pHmeter dan
Spektrofotometer UV-Vis. [terhubung berkala] http://iqmal.staff.ugm.ac.id/wp-content/iqmal-2008-kalibrasi.pdf
( 2 maret 2012)
http://devagerald.wordpress.com/2012/03/05/laporan-sentrifus/
Tidak ada komentar:
Posting Komentar